Рис. 1. Морфы бабочек желтушек на примере двух видов. У Colias eurytheme (вверху) окраска крыльев самцов оранжевая, а у Colias crocea — желтая. У обоих видов имеется две морфы самок: одна такая же яркая, как самцы (рецессивные гомозиготы), а другая — белая (доминантные гомозиготы и гетерозиготы). Первый вид обитает в Северной Америке, второй — в Евразии (см. рис. 2). Их популяции между собой никогда не встречаются в природе. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science Advances

У многих видов бабочек рода Colias (желтушки) встречаются две хорошо различимые морфы самок: с ярко-желтыми/ярко-оранжевыми крыльями и с белыми крыльями. Признак наследуется как моногенный, причем именно белая окраска доминирует над цветной. Встречаемость белой морфы в разных популяциях и у разных видов варьирует. Цвет крыльев бабочек коррелирует с несколькими физиологическими и поведенческими признаками, касающимися роста и репродукции. Недавно в журнале Science Advances были опубликованы результаты исследования, направленного на изучение генетической основы этого полиморфизма. Оказалось, что у всех изученных видов (21 вид) за формирование белых крыльев отвечает одна и та же мутация в энхансере, регулирующем ген BarH1 (он кодирует транскрипционный фактор). Сам энхансер расположен на расстоянии нескольких тысяч нуклеотидов от этого гена. Такая ситуация объясняется во-первых, древним происхождением мутации, предшествовавшим дивергенции видов, а во-вторых, балансирующим отбором, сохраняющим оба варианта на протяжении вот уже нескольких миллионов лет. Также, по-видимому, имеет место и интрогрессия — перенос генов от одного вида к другому за счет межвидовой гибридизации.

Род бабочек Colias — желтушки — включает около 90 видов. Название рода объясняется свойственной этим бабочкам ярко-желтой или ярко-оранжевой окраской крыльев. По крайней мере таковы все самцы этого рода. У самок примерно для трети видов желтушек наряду с цветной морфой описано наличие белой морфы (alba), еще у трети видов все самки такие же яркие, как самцы, а у оставшейся трети все самки — белые (рис. 1). Бабочки-желтушки обитают на всех континентах, кроме Антарктиды и Австралии (рис. 2). И на всех континентах можно обнаружить виды, у которых встречается морфа alba.

Рис. 2. География распространения бабочек рода Colias. Приведены только те виды, которые включены в исследование. У большинства из этих видов присутствует полиморфизм окраски крыльев среди самок. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science Advances

Эта особенность сделала бабочек-желтушек объектом пристального внимания для биологов, чьи интересы лежат в области популяционной генетики и эволюции. В частности, можно озадачиться целым рядом вопросов:

• Имеем ли мы дело с нейтральной изменчивостью или же речь идет об адаптивно значимом полиморфизме?
• Если это адаптация, то в чем именно заключается преимущество?
• Каков механизм поддержания полиморфизма: видим ли мы промежуточный этап эволюции, когда новый мутантный вариант постепенно вытесняет менее приспособленный предковый вариант фенотипа, или здесь имеет место балансирующий отбор?
• Какова генетическая основа формирования разных вариантов фенотипа?
• Возник ли признак уже у общего предка рода желтушек или он возникал у разных представителей рода параллельно и независимо?

Исследование выполнено коллективом авторов из Стокгольмского университета под руководством Кристофера Уита (Christopher Wheat) в сотрудничестве с учеными из США, Финляндии и России. Прежде чем мы приступим к изложению содержания последней публикации, нельзя не сказать о тех интересных фактах, которые были установлены в отношении бабочек-желтушек ранее, в большой мере при участии этой же группы исследователей.

Различия в окраске желтушек обусловлены различным содержанием в чешуйках крыльев пигментов птеринов, которые в зависимости от структуры бывают желтыми (ксантоптерин), красными (эритроптерин) и белыми (лейкоптерин). Обе морфы синтезируют птерины, но в разных количествах и пропорциях. У желтушек преимущественно формируются желтые и красные птерины. У морфы alba суммарное количество птеринов заметно ниже, чем у цветных, причем больше всего снижен синтез желтых и красных птеринов.

Тот факт, что однотипный полиморфизм окраски наблюдается у многих видов и что во всех таких случаях оба варианта фенотипа обычно присутствуют в высокой частоте (более 1%), указывает на то, что наиболее вероятной причиной является действие балансирующего отбора.

Балансирующий отбор — это такая форма отбора, которая обеспечивает сохранение одновременно двух (или более) разных аллелей одного и того же гена. Но в основе балансирующего отбора могут быть разные причины. Например, в случае сверхдоминирования приспособленность гетерозиготного генотипа оказывается выше, чем любой из возможных гомозигот. Другой случай — когда каждый из генотипов реализует свою собственную стратегию и эти стратегии в целом уравновешивают друг друга по эффективности: каждая в чем-то имеет преимущество, а в чем-то уступает другой. Бывает так, что одна стратегия лучше работает в одних параметрах среды (скажем, это может быть температура, влажность, обилие корма и т. д.), а другая — в других. Поскольку среда не остается абсолютно неизменной, это приводит к тому, что время от времени отбор меняет направление, благоприятствуя то одним, то другим генотипам.

Выгода белой морфы состоит в экономии ресурсов на этапе формирования пигмента в крыльях (этот этап протекает на стадии куколки). Молекулы птерина содержат большое количество атомов азота и синтезируются из молекул ГТФ. Молекулы ГТФ вместе с тем непосредственно участвуют в синтезе РНК и ДНК, а также служат источником энергии для множества биохимических реакций, включая синтез белка. Было вычислено, что бабочка морфы alba экономит на синтезе птеринов около 0,4 мг ГТФ, что соответствует нескольким процентам всего азота, накопленного гусеницей к моменту окукливания. Благодаря такой экономии куколки морфы alba быстрее созревают и формируют больше яиц по сравнению с цветными.

Вместе с тем, самки морфы alba менее привлекательны для самцов. За сезон размножения (взрослые бабочки живут до 4 дней — за это время им нужно успеть произвести оплодотворение и отложить яйца) цветные бабочки успевают поучаствовать в большем числе спариваний (разница в несколько раз). Самцы особенно склонны игнорировать белых самок на тех территориях, где вместе с ними живут другие схожие виды бабочек с белыми крыльями: слишком велик шанс ошибиться и понапрасну растратить силы на ухаживания за самку не своего вида. Сперматофоры насекомых богаты белком, так что вместе со сперматозоидами самка при каждом спаривании получает дополнительную порцию питательных веществ, а это, в свою очередь, положительно влияет на выживаемость новорожденных гусениц. Кроме того, цветные бабочки вообще проводят больше времени в полете и успевают съесть больше нектара, в то время как белые гораздо больше времени просто сидят и отдыхают. Возможно, это связано с тем, что цветным бабочкам за счет светопоглощения проще поддерживать достаточно высокую температуру тела для активного полета. Это опять же положительно сказывается на накоплении питательных веществ в их яйцах.

Косвенная выгода ярких самок может заключаться еще и в том, что благодаря разворачивающейся за них острой конкуренции между самцами именно им в качестве партнеров для спаривания и будущих отцов потомства достаются лучшие из лучших.

В лабораторных испытаниях было показано, что фенотип alba обладает наибольшим преимуществом при более низкой температуре на стадиях гусеницы и куколки, а также при питании на растениях, более бедных азотом. Вместе с тем, самки морфы alba проигрывают при повышенных температурах. Оказалось, что в куколках двух морф различается количественное распределение разных типов липидов. Куколки цветных бабочек содержат больше холестерола — и это может быть фактором их более высокой выживаемости при повышенной температуре. Действительно, среди видов желтушек, населяющих Северную Америку, прослеживается явная закономерность: чем севернее ареал вида, тем больше доля самок морфы alba в его популяциях. Эта же закономерность проявляет себя и в различии популяций двух видов из перекрывающихся ареалов в высокогорном районе штата Колорадо: Colias alexandra и Colias scudderi (M. G. Nielsen, W. B. Watt, 2002. Behavioural fitness component effects of the alba polymorphism of Colias (Lepidoptera, Pieridae): resource and time budget analysis). Первый из этих двух видов живет на лугу, их гусеницы кормятся на душистом горошке (бобовые, богатая азотом растительность), второй же обитает в лесистых зонах и кормится на листьях ивы. Здесь среднесуточная температура на несколько градусов ниже и азота заметно меньше. У первого вида на долю морфы alba приходится около 5% (с колебаниями в разные годы), а у второго — 80–90%.

Таким образом, каждая морфа имеет свой козырь в рукаве. Интересно, что при размножении в лаборатории часть особей с гетерозиготным генотипом могли иметь слегка желтоватый оттенок крыльев. Но куколки таких бабочек развивались намного дольше и по всем параметрам проигрывали ярко-желтым или чисто белым сородичам. Таким образом, крайне маловероятно, чтобы причиной поддержания полиморфизма у желтушек могло быть преимущество гетерозигот.

Вернемся к новой работе. Ее целью стало установление генетической детерминации признака на молекулярном уровне и эволюционной истории появления диморфизма самок у множества видов рода Colias.

Исследование опирается на несколько методов. Один из них — GWAS (genome wide association study — полногеномный поиск ассоциаций). Суть его состоит в поиске корреляции между определенными вариантами последовательностей в ДНК (SNP) и изучаемым признаком. Анализ геномов бабочек двух морф (по 15 каждой) позволил обнаружить локус, уникальный для alba. Это оказалась вставка длиной 1200 нуклеотидов, обнаруживаемая у всех самок с фенотипом alba, но не у цветной морфы. Первоначально эту вставку выявили в геномах двух видов (Colias eurytheme и C. croceus), а затем целенаправленно проверили ее присутствие у морф еще 19 видов. Во всех случаях вставка присутствовала только у alba и во всех случаях она размещалась вблизи гена BarH1 (на расстоянии около 25 тысяч нуклеотидов от гена). Белок BarH1 — это транскрипционный фактор, известный широким спектром функций в регуляции развития у насекомых (собственно, название гена происходит от обозначения фенотипа мутантных мух дрозофил, имеющих глаза в виде узких полосок). Вставка оказалась консервативной, незначительно различаясь у разных видов желтушек.

Далее следовало разрешить вопрос: как вышло, что совершенно разные виды имеют одну и ту же вставку у части особей. Это мутация, унаследованная от предка, или она была разнесена за счет межвидовых гибридизаций? Был проведен филогенетический анализ последовательностей. Использовали данные полногеномного секвенирования для 21 вида. Чтобы построить филогению видов желтушек, ученые использовали последовательности самых длинных экзонов из более чем 4000 ортологичных генов, представленных у каждого вида единственной копией. Полученное дерево в целом хорошо согласуется с географией распространения бабочек.

При помощи специальных математических методов ученые оценили степень интрогрессии генов между разными видами. Оказалось, что переносы между видами действительно имели место, но в основном это происходило между видами из близких или перекрывающихся ареалов. Дерево, построенное только на основе последовательности вставки (1200 нуклеотидов), содержит признаки возможного переноса этого варианта от вида к виду, но все же наиболее крупные ветви этого дерева хорошо согласуются с общим деревом (рис. 3). Так, в обоих деревьях виды C. eurytheme и C. croceus оказались в двух разных больших кладах. Время разделения этих клад — около 1,5 миллионов лет назад, а последовательность вставки этих двух видов совпадает на 96%. С учетом всех проанализированных данных можно с высокой уверенностью утверждать, что обнаруженная вставка, характерная для морфы alba, возникла еще у общего предка всего рода. И это значит, что те виды, которые имеют единственную морфу самок (белую или желтую), когда-то в прошлом потеряли одну из морф по какой-то причине.

Рис. 3. Результаты филогенетического анализа. Слева — дерево, построенное на основе последовательностей нескольких тысяч отобранных генов, справа — дерево, построенное на основе анализа последовательности вставки, обнаруженной у морфы alba. В этих деревьях синий цвет соответствует видам Северной Америки, желтый — видам Арктического региона, зеленый — видам, обитающим на территории Евразии и Северной Америки, сиреневый — южноамериканским видам. На правом дереве длина ветви соответствует степени изменения последовательности. В некоторых ветвях на этой схеме указан один и тот же вид — в этом случае анализировали последовательности от нескольких особей данного вида из разных популяций. Получить и проанализировать последовательности локуса alba удалось для 14 видов из 21. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science Advances

Каким же образом указанная вставка влияет на признак? Авторы предположили, что она функционирует как энхансер (усилитель транскрипции) по отношению к гену BarH1, а тот в свою очередь каким-то образом подавляет синтез птеринов. Чтобы проверить эту гипотезу, был предпринят эксперимент по редактированию генома с использованием системы CRISPR/Cas9.

Сначала при помощи биоинформатического инструмента провели поиск потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов, известных для насекомых. Среди них оказалось два сайта узнавания для фактора Dsx (doublesex), который у мух отвечает за признаки, ассоциированные с полом (этот факт здесь имеет особое значение — ведь морфа alba свойственна только самкам). С учетом расположения предсказанных сайтов подобрали четыре гРНК для нацеливания белка Сas9: две из них непосредственно затрагивают сайты Dsx, другие две находятся слева и справа от первых на расстоянии около 200 нуклеотидов. Охваченный в итоге участок содержит наиболее плотно размещающиеся предсказанные сайты связывания факторов транскрипции. Для проведения мутагенеза белок вместе со всеми четырьмя гРНК при помощи микроинъекции вводили в яйцо бабочки (эксперименты проводили на бабочках C. croceus) в первые же часы после кладки.

В этом видео рассказано, как проводятся эксперименты по геномному редактированию с использованием системы CRISPR/Cas у бабочек

Из 200 яиц, подвергнутых этой операции, удалось получить 39 живых гусениц, но до стадии бабочки смогли дожить только пять из них: два самца, одна оранжевая самка и две самки с фенотипом alba. На фоне белых крыльев у этих самочек наблюдалась мозаика из оранжевых фрагментов — именно это и ожидали увидеть ученые (рис. 4). Аналогичная мозаичность проявилась и при нацеливании редактирующей системы на кодирующий экзон гена BarH1.

Рис. 4. Результаты экспериментов по редактированию генома бабочки. Показаны мутанты, полученные для генотипа alba. Вверху — результат введения мутации с потерей функции в экзон гена BarH1. Внизу — результат введения мутации в область предполагаемого энхансера гена BarH1. На схеме в середине показан ген и расположенная в стороне от него последовательность энхансера. Стрелками указаны места, на которые нацеливали систему CRISPR/Cas9. Введенные мутации затрагивают лишь часть клеток эмбриона, в результате чего получается мозаицизм признака. При мутировании белок-кодирующей последовательности возникают аномалии в виде желтых пятен на крыльях и темных разводов на глазах. При мутировании энхансера изменяется только окраска крыльев. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science Advances

Как показали эксперименты, локус действительно представляет собой новый регуляторный элемент, причем этот энхансер изменяет экспрессию гена BarH1 локально, то есть влияет только на пигментацию крыльев, но не на пигментацию глаз и не на другие жизненно важные функции гена. Важно отметить, что у мутантов, кроме изменений в пигментации, обнаружились также и ожидаемые изменения в спектре запасаемых в куколке липидов. Это значит, что наличие или отсутствие вставки в геноме бабочек влияет одновременно и на морфологические, и на физиологические особенности бабочек, — это тот случай, когда говорят о плейотропном (множественном) эффекте аллелей.

Таким образом, исследование показало, что мутация, попавшая под действие балансирующего отбора, может сохраняться очень долго. В том числе — и на фоне интенсивного видообразования: ведь возраст рода желтушек, состоящего из почти сотни видов, оценивается примерно в 2,5 миллиона лет. К этому можно добавить, что несколько ранее другая группа исследователей провела масштабный анализ эволюции диморфизма самок в еще более обширной группе — подсемействе Coliadinae (включающего около 190 видов бабочек), в которую вместе с желтушками входит еще более десятка родов (L. B. Limeri, N. I. Morehouse, 2016. The evolutionary history of the ‘alba’ polymorphism in the butterfly subfamily Coliadinae (Lepidoptera: Pieridae)). Их заключение еще более сильное: авторы утверждают, что, вероятнее всего, диморфизм возник уже у общего предка всего подсемейства, сохраняясь с тех пор у представителей множества родов этого подсемейства (рис. 5). Что ж, теперь, зная где искать, исследователи имеют возможность найти надежное подтверждение (или опровержение) этому предположению.

Рис. 5. Филогенетическое дерево и предполагаемая история эволюции расцветок подсемейства бабочек Coliadinae. Разбитые на сектора кружочки во внутренних узлах дерева отражают распределение вероятности того, что данный предковый вид имел мономорфный цветной фенотип, фенотип alba, либо же был полиморфным. В кружочках справа от наименования рода отражена доля видов, которым свойственен полиморфизм или мономорфизм самок. Площадь кружочков около каждого рода отражает размер рода (число видов). Род Colias самый большой в подсемействе. Согласно этой схеме, предок данного рода был уже полиморфным, а мономорфность у двух третей видов — следствие вторичной утраты цветной или белой морф (этот же вывод делают и авторы обсуждаемой работы). Общий предок всего подсемейства также с высокой вероятностью был полиморфным. Рисунок из статьи L. B. Limeri, N. I. Morehouse, 2016. The evolutionary history of the ‘alba’ polymorphism in the butterfly subfamily Coliadinae (Lepidoptera: Pieridae)

Источник: Kalle Tunström, Alyssa Woronik, Joseph J. Hanly, Pasi Rastas, Anton Chichvarkhin, Andrew D. Warren, Akito Y. Kawahara, Sean D. Schoville, Vincent Ficarrotta, Adam H. Porter, Ward B. Watt, Arnaud Martin, Christopher W. Wheat. Evidence for a single, ancient origin of a genus-wide alternative life history strategy // Science Advances. 2023. DOI: 10.1126/sciadv.abq3713.

Татьяна Романовская

Read Full Article